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1 概述2

1.1 基因工程的基本概念2

1.1.1 基因工程的基本定义2

1.1.2 基因工程的基本过程2

1.1.3 基因工程的基本原理3

1.1.4 基因工程在生物工程中的地位3

1.2 基因工程的发展历史5

1.2.1 基因工程的诞生5

1.2.2 基因工程的成熟5

1.2.3 基因工程的腾飞6

1.3 基因工程的研究意义7

1.3.1 第四次工业大革命7

1.3.2 第二次农业大革命8

1.3.3 第四次医学大革命8

2 DNA重组克隆的单元操作12

2.1 DNA重组的载体12

2.1.1 质粒载体12

2.1.1.1 质粒的基本特性12

2.1.1.2 质粒的改造与构建13

2.1.1.3 质粒的分类及用途15

2.1.1.4 质粒的分离与纯化16

2.1.2 λ双链噬菌体DNA载体17

2.1.2.1 λ噬菌体的生物学特征17

2.1.2.2 λ-DNA载体的构建19

2.1.2.3 λ-DNA载体的分类及用途20

2.1.2.4 λ-DNA的分离与纯化22

2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体22

2.1.3.1 M13噬菌体的生物学特性22

2.1.3.2 M13-DNA的改造23

2.1.4 噬菌体-质粒杂合载体24

2.1.4.1 黏粒载体24

2.1.4.2 噬菌粒载体25

2.1.5 人造染色体载体26

2.2 DNA的体外重组（切与接）26

2.2.1 限制性核酸内切酶26

2.2.1.1 限制性核酸内切酶的发现26

2.2.1.2 Ⅰ和Ⅲ类限制-修饰酶的基本特征27

2.2.1.3 Ⅱ类限制性核酸内切酶的基本特征28

2.2.1.4 甲基化酶的基本特征31

2.2.2 T4-DNA连接酶32

2.2.3 其他用于DNA重组的工具酶32

2.2.3.1 Klenow酶32

2.2.3.2 末端脱氧核苷酰转移酶34

2.2.3.3 S1核酸酶35

2.2.3.4 Bal31核酸酶35

2.2.3.5 T4-多核苷酸磷酸激酶36

2.2.3.6 碱性磷酸单酯酶36

2.2.3.7 T4-DNA聚合酶36

2.2.4 DNA切接反应的影响因素36

2.2.4.1 限制性核酸内切酶的切割反应36

2.2.4.2 T4-DNA连接酶的连接反应38

2.2.4.3 重组率及其影响因素38

2.2.5 DNA分子重组的方法39

2.2.5.1 相同黏性末端的连接39

2.2.5.2 平头末端的连接41

2.2.5.3 不同黏性末端的连接41

2.2.5.4 人工黏性末端的连接43

2.2.5.5 酶切位点的定点更换45

2.3 重组DNA分子的转化与扩增（转与增）47

2.3.1 重组DNA转化的基本概念47

2.3.2 受体细胞的选择48

2.3.2.1 限制缺陷型48

2.3.2.2 重组缺陷型48

2.3.2.3 转化亲和型49

2.3.2.4 遗传互补型49

2.3.2.5 感染寄生缺陷型49

2.3.3 转化方法50

2.3.3.1 Ca2＋诱导转化50

2.3.3.2 PEG介导的细菌原生质体转化51

2.3.3.3 电穿孔驱动的完整细胞转化51

2.3.3.4 接合转化52

2.3.3.5 λ噬菌体的转染53

2.3.4 转化率及其影响因素53

2.3.4.1 转化率的定义53

2.3.4.2 转化率的用途54

2.3.4.3 转化率的影响因素54

2.3.5 转化细胞的扩增55

2.4 转化子的筛选与重组子的鉴定（检）55

2.4.1 基于载体遗传标记的筛选与鉴定55

2.4.1.1 抗药性筛选法56

2.4.1.2 营养缺陷性筛选法57

2.4.1.3 显色模型筛选法57

2.4.1.4 噬菌斑筛选法58

2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定58

2.4.2.1 PCR鉴定法58

2.4.2.2 菌落原位杂交法59

2.4.2.3 限制性酶切图谱法62

2.4.2.4 亚克隆法64

2.4.2.5 DNA序列测定法66

2.4.3 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定71

2.4.3.1 蛋白质生物功能检测法71

2.4.3.2 放射免疫原位检测法73

2.4.3.3 蛋白凝胶电泳检测法73

2.5 目的基因的克隆75

2.5.1 鸟枪法75

2.5.1.1 鸟枪法的基本程序76

2.5.1.2 非随机鸟枪法战略77

2.5.1.3 鸟枪法克隆目的基因的局限性78

2.5.2 cDNA法79

2.5.2.1 mRNA的分离纯化79

2.5.2.2 双链cDNA的体外合成81

2.5.2.3 双链cDNA的克隆83

2.5.2.4 cDNA重组克隆的筛选85

2.5.3 PCR扩增法85

2.5.3.1 PCR扩增DNA的基本原理86

2.5.3.2 PCR扩增产物的克隆89

2.5.3.3 PCR扩增技术的应用92

2.5.4 化学合成法93

2.5.4.1 寡聚核苷酸单链的化学合成93

2.5.4.2 目的基因的化学合成95

2.5.5 基因文库的构建96

2.5.5.1 基因文库的完备性97

2.5.5.2 基因文库的构建战略97

2.5.5.3 基因组文库重组克隆的排序99

2.5.5.4 基因文库的筛选100

3 大肠杆菌基因工程104

3.1 外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理104

3.1.1 启动子104

3.1.1.1 启动子最佳作用距离的探测104

3.1.1.2 启动子的筛选与构建104

3.1.1.3 启动子的可控性106

3.1.1.4 依赖于噬菌体RNA聚合酶的启动子系统108

3.1.2 终止子108

3.1.3 SD序列109

3.1.4 密码子110

3.1.5 质粒拷贝数111

3.2 大肠杆菌工程菌的构建策略113

3.2.1 包含体型异源蛋白的表达113

3.2.1.1 包含体的性质113

3.2.1.2 包含体的形成机制114

3.2.1.3 包含体的分离115

3.2.1.4 重组异源蛋白表达系统的构建115

3.2.2 分泌型异源蛋白的表达118

3.2.2.1 分泌型异源蛋白表达的特性118

3.2.2.2 蛋白质的传输和分泌机制118

3.2.2.3 分泌型异源蛋白表达系统的构建120

3.2.3 融合型异源蛋白的表达121

3.2.3.1 融合型异源蛋白表达的特性121

3.2.3.2 融合型异源蛋白表达系统的构建121

3.2.3.3 异源蛋白从融合蛋白中的回收123

3.2.4 寡聚型异源蛋白的表达124

3.2.5 整合型异源蛋白的表达128

3.2.6 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建129

3.2.6.1 细胞内蛋白质降解的基本特征129

3.2.6.2 蛋白酶缺陷型受体细胞的改造130

3.2.6.3 抗蛋白酶的重组异源蛋白序列设计130

3.3 重组异源蛋白的体外复性活化131

3.3.1 包含体的溶解与变性131

3.3.1.1 清洗剂的溶解变性作用132

3.3.1.2 促溶剂的溶解变性作用132

3.3.1.3 极端pH的溶解变性作用133

3.3.1.4 混合溶剂的溶解变性作用133

3.3.2 异源蛋白的复性与重折叠133

3.3.2.1 重组异源蛋白纯度对重折叠的影响133

3.3.2.2 重折叠方法的选择134

3.3.2.3 二硫键的形成135

3.3.2.4 折叠辅助蛋白因子的应用137

3.4 大肠杆菌工程菌培养的最优化控制138

3.4.1 细菌生长的动力学原理138

3.4.1.1 分批式发酵138

3.4.1.2 流加式发酵139

3.4.1.3 连续式发酵139

3.4.2 发酵过程的最优化控制140

3.4.2.1 工程水平的优化控制140

3.4.2.2 分子水平的优化控制142

3.4.2.3 细胞水平的优化控制142

3.4.3 大肠杆菌工程菌的高密度发酵143

3.4.3.1 高密度发酵培养基的设计143

3.4.3.2 高密度发酵的温度控制144

3.4.3.3 高密度发酵的溶氧控制144

3.5 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策145

3.5.1 工程菌遗传不稳定性的表现与机制145

3.5.2 改善工程菌不稳定性的对策146

3.5.2.1 改进载体宿主系统146

3.5.2.2 施加选择压力147

3.5.2.3 控制外源基因过量表达147

3.5.2.4 优化培养条件148

3.6 利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽149

3.6.1 胰岛素的结构及其生物合成149

3.6.2 人胰岛素的生产方法150

3.6.3 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略152

3.6.3.1 AB链分别表达法152

3.6.3.2 人胰岛素原表达法152

3.6.3.3 AB链同时表达法153

4 酵母基因工程158

4.1 酵母的宿主系统158

4.1.1 提高重组异源蛋白产率的突变宿主158

4.1.2 抑制超糖基化作用的突变宿主159

4.1.3 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主159

4.1.4 内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主161

4.2 酵母的载体系统161

4.2.1 酿酒酵母中的2μ环状质粒161

4.2.2 乳酸克鲁维酵母中的线状质粒162

4.2.3 果蝇克鲁维酵母中的环状质粒163

4.2.4 含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建163

4.2.5 含有CEN的YCp载体及其构建164

4.2.6 含有TEL的YAC载体及其构建164

4.3 酵母的转化系统166

4.3.1 酵母的转化程序167

4.3.2 转化质粒在宿主细胞中的命运167

4.3.3 用于转化子筛选的标记基因168

4.4 酵母的表达系统170

4.4.1 酵母启动子的基本特征与选择170

4.4.2 酵母启动子的可调控表达系统171

4.4.2.1 温度控制表达系统171

4.4.2.2 超诱导表达系统172

4.4.2.3 严紧控制表达系统173

4.4.3 外源基因在酵母中表达的限制性因素173

4.4.4 酵母表达系统的选择174

4.4.4.1 乳酸克鲁维酵母表达系统174

4.4.4.2 巴斯德毕赤酵母表达系统175

4.4.4.3 多型汉逊酵母表达系统177

4.5 酵母菌的蛋白修饰分泌系统177

4.5.1 蛋白质的分泌运输机制177

4.5.2 信号肽及其剪切系统178

4.5.3 分泌型蛋白的糖基化修饰180

4.6 利用重组酵母生产乙肝疫苗182

4.6.1 乙肝病毒的结构182

4.6.2 产乙肝表面抗原的酿酒酵母重组菌的构建183

4.6.3 产乙肝表面抗原的巴斯德毕赤酵母重组菌的构建183

4.7 利用重组酵母生产人血清清蛋白184

5 高等动物基因工程188

5.1 动物转基因技术的基本概念188

5.1.1 动物转基因的效率188

5.1.2 动物转基因的结构188

5.1.3 动物转基因的表达特性189

5.1.3.1 转基因的时空特异性表达189

5.1.3.2 转基因的可控性表达189

5.1.3.3 转基因的共抑制效应189

5.1.4 动物转基因的生物学效应190

5.2 转基因导入动物体内的方法190

5.2.1 转基因的动物受体细胞系统190

5.2.2 动物细胞物理转化法192

5.2.2.1 磷酸钙共沉淀法192

5.2.2.2 电击法192

5.2.2.3 脂质体包埋法192

5.2.2.4 DNA显微注射法192

5.2.3 动物病毒转染法193

5.2.3.1 腺病毒193

5.2.3.2 猴肿瘤病毒194

5.2.3.3 牛痘病毒195

5.2.3.4 反转录病毒196

5.2.4 工程胚胎干细胞法198

5.2.5 体细胞转基因克隆法200

5.3 利用动物转基因技术研究基因的表达与功能200

5.3.1 利用转报告基因探测动物基因组的调控序列200

5.3.2 利用同源基因灭活细胞内源基因202

5.3.3 利用Cre-IoxP系统条件性敲除基因203

5.3.4 利用反义基因抑制细胞基因表达203

5.3.5 利用干扰RNA阻断特定基因表达203

5.4 利用转基因动物或细胞生产生物大分子205

5.4.1 动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理205

5.4.2 利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产结构复杂的人体蛋白207

5.4.3 利用动物乳腺组织生产蛋白药物207

5.5 转基因技术在动物遗传性状改良中的应用209

5.5.1 转基因鼠209

5.5.1.1 转基因鼠在揭示人类分子病病理中的应用209

5.5.1.2 转基因鼠在研究高等哺乳动物发育机制中的应用210

5.5.2 转基因兔、猪、羊210

5.5.3 转基因牛211

5.5.4 转基因鸡211

5.5.5 转基因鱼212

5.6 基因治疗212

5.6.1 基因治疗的基本战略思想212

5.6.1.1 基因治疗的基本概念212

5.6.1.2 基因治疗的基本内容213

5.6.1.3 基因转移的基本方式213

5.6.1.4 基因治疗的分子机制214

5.6.2 肿瘤的基因治疗214

5.6.2.1 增强肿瘤细胞的免疫原性215

5.6.2.2 提高人体的免疫机能215

5.6.2.3 改变癌基因和抑癌基因的表达特性216

5.6.2.4 修饰肿瘤细胞和正常细胞的药物敏感性217

5.6.3 囊性纤维变性症的基因治疗217

5.6.4 杜兴肌营养不良症的基因治疗218

5.6.5 重度联合免疫缺陷症的基因治疗218

5.6.6 糖尿病的基因治疗战略219

5.6.7 骨髓细胞的转基因研究219

5.6.8 基因治疗的副反应及其对策220

6 高等植物基因工程224

6.1 高等植物的遗传学特性224

6.2 高等植物的基因转移系统225

6.2.1 Ti质粒介导的整合转化系统225

6.2.1.1 Ti质粒的分子遗传学特性225

6.2.1.2 野生型Ti质粒的改造227

6.2.1.3 Ti质粒介导的共整合转化系统227

6.2.1.4 Ti质粒介导的二元整合转化系统228

6.2.1.5 Ti质粒介导的整合转化程序的特点228

6.2.2 植物病毒介导的转染系统230

6.2.2.1 植物病毒载体的基本性质230

6.2.2.2 植物重组病毒的操作战略232

6.2.2.3 植物病毒介导的转染系统的特点233

6.2.3 植物细胞的直接转化方法234

6.2.3.1 植物细胞的物理直接导入法234

6.2.3.2 植物细胞的化学直接导入法235

6.2.3.3 植物细胞的生物直接导入法235

6.2.4 植物原生质体的再生235

6.3 高等植物的基因表达系统236

6.3.1 外源基因的四环素诱导系统237

6.3.1.1 Tc-on型四环素诱导系统237

6.3.1.2 Tc-off型四环素阻遏系统238

6.3.2 外源基因的乙醇诱导系统238

6.3.3 外源基因的类固醇诱导系统239

6.3.3.1 糖（肾上腺）皮质激素诱导系统239

6.3.3.2 雌激素诱导系统239

6.3.3.3 蜕皮激素诱导系统240

6.3.4 外源基因的地塞米松诱导和四环素抑制系统241

6.4 利用植物转基因技术研究基因的表达与调控241

6.4.1 利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱241

6.4.2 利用病毒载体探查植物基因重排242

6.4.3 利用转座元件克隆植物基因242

6.4.4 利用T-DNA构建植物遗传突变株243

6.5 利用转基因植物生产重组异源蛋白和工业原料243

6.5.1 利用植物生物反应器生产医用蛋白243

6.5.2 利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂245

6.5.3 利用植物生物反应器生产工业原料245

6.6 转基因技术在植物品种改良中的应用246

6.6.1 控制果实成熟的转基因植物246

6.6.2 抗虫害的转基因植物246

6.6.2.1 含毒晶蛋白编码基因的转基因植物247

6.6.2.2 含蛋白酶抑制剂编码基因的转基因植物247

6.6.3 抗病原体的转基因植物248

6.6.4 抗除草剂的转基因植物248

6.6.5 改变花型花色的转基因植物249

6.6.6 抗环境压力的转基因植物250

6.6.7 产生高品质产物的转基因植物250

6.6.8 转基因植物的安全性251

7 第二代基因工程——蛋白质工程251

7.1 蛋白质工程的基本概念254

7.1.1 蛋白质工程的基本特征254

7.1.2 蛋白质工程的研究内容及应用255

7.1.3 蛋白质工程实施的必要条件255

7.2 基因的体外定向突变256

7.2.1 局部随机掺入法256

7.2.2 碱基定点转换法257

7.2.3 部分片段合成法258

7.2.4 引物定点引入法259

7.2.5 PCR扩增突变法260

7.3 基因的体外定向进化262

7.3.1 易错PCR263

7.3.2 DNA改组264

7.3.3 体外随机引发重组266

7.3.4 交错延伸267

7.3.5 过渡模板随机嵌合生长267

7.3.6 渐增切割杂合酶生成268

7.3.7 同源序列非依赖性蛋白质重组269

7.3.8 突变文库的筛选模型269

7.4 蛋白质工程的设计思想与应用271

7.4.1 提高蛋白质或酶的稳定性271

7.4.1.1 引入二硫键以提高蛋白质或酶的稳定性271

7.4.1.2 转换氨基酸残基以提高蛋白质或酶的稳定性272

7.4.2 减少重组多肽链的错误折叠274

7.4.3 改善酶的催化活性274

7.4.3.1 转换氨基酸残基以改善酶的催化活性274

7.4.3.2 随机改组肽段以改善酶的催化活性275

7.4.3.3 删除末端部分氨基酸序列以改善酶的催化活性275

7.4.4 消除酶的被抑制特性276

7.4.4.1 转换氨基酸残基以消除酶的被抑制特性276

7.4.4.2 删除肽段以消除酶的被抑制特性277

7.4.5 修饰酶的催化特异性277

7.4.5.1 共价结合？核苷酸以修饰酶的催化特异性277

7.4.5.2 转换氨基酸残基以修饰酶的催化特异性278

7.4.6 强化配体与其受体的亲和性279

7.4.6.1 随机点突变以强化配体与其受体的亲和性279

7.4.6.2 基因家族改组以强化配体与其受体的亲和性281

7.4.7 降低异源蛋白药物的免疫原性282

8 第三代基因工程——途径工程286

8.1 途径工程的基本概念286

8.2 途径工程的研究战略291

8.2.1 在现存途径中提高目标产物的代谢流291

8.2.2 在现存途径中改变物质流的性质293

8.2.3 利用已有途径构建新的代谢旁路294

8.3 初级代谢的途径工程296

8.3.1 乙醇生产菌的途径操作297

8.3.1.1 发酵生产乙醇的基本战略297

8.3.1.2 酵母属乙醇发酵途径的改良299

8.3.1.3 高产乙醇的重组大肠杆菌的构建301

8.3.1.4 直接利用太阳能合成乙醇的光合细菌途径设计302

8.3.2 辅酶Q生产菌的途径操作303

8.3.2.1 辅酶Q的生物合成途径304

8.3.2.2 辅酶Q10的医疗保健功能305

8.3.2.3 辅酶Q10的大规模产业化现状307

8.3.2.4 高产辅酶Q10工程菌构建的战略309

8.3.3 氢气生产菌的途径操作309

8.4 次级代谢的途径工程310

8.4.1 聚酮生物合成的分子机制310

8.4.2 聚酮合酶各组成模件的操作战略311

8.4.2.1 缺失或增加模件以控制链长312

8.4.2.2 置换定位结构域以拓宽起始单位的使用范围312

8.4.2.3 置换酰基转移酶结构域以产生杂合衍生物312

8.4.2.4 还原环的遗传操作313

8.4.2.5 人工合酶和聚酮文库的构建313

8.4.2.6 聚酮内和聚酮间接头的设计314

8.4.3 聚酮生物合成基因的异源表达314