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第Ⅰ部分：供蛋白质组学分析的蛋白样品制备3

第1章 分离科学在蛋白质组学中的作用3

制备纯化蛋白：蛋白质微阵和结构蛋白质组学的瓶颈5

以质谱为基础的蛋白质鉴定6

蛋白质组学所面临的一个关键技术的挑战：减少样品的复杂性7

本书的概述73

参考文献14

选读文献15

网络资源15

第2章 蛋白质的纯化策略16

挑战17

蛋白质的量和纯度要求17

重组蛋白通常能简化纯化过程20

可根据蛋白质的内在特性来分离蛋白质22

设计蛋白质纯化方案26

应用：膜相关抗原A33的纯化31

参考文献35

选读文献36

第Ⅱ部分：蛋白质组学中制备蛋白样品的色谱方法39

第3章 蛋白质和肽纯化的色谱方法导论39

基本概念40

色谱性能48

实验方案60

方案1轻拍-填装法干式填装刚性固体柱60

色谱术语表62

参考文献69

选读文献69

网络资源69

第4章 全蛋白的多维色谱70

MDLC用于蛋白质分级分离的目的71

策略72

主要文献概述74

MDLC的理论参数75

色谱模式：正交性与相容性77

与其他技术的性能比较80

MDLC的常见问题82

发展潜力84

样品处理方案：SEC／反相色谱法分离大肠杆菌蛋白84

研究实例：MDLC分析酵母蛋白提取物88

结论90

参考文献91

第5章 可溶性重组蛋白的高通量筛选93

引言94

实验方案97

方案1设计平行克隆表达载体97

方案2平行克隆所用载体的制备98

方案3黏末端PCR产物的制备和消化载体的连接100

方案4把DNA转化到细菌中103

方案5诱导和筛选可溶性融合蛋白106

参考文献110

第6章 离子交换色谱111

IEC利用了分子间的静电力112

几种IEC的模式115

IEC中缓冲液的选择很重要115

离子交换介质和色谱分离装置118

实验方案121

方案1离子交换柱的选择121

方案2离子交换柱的制备125

方案3用IEC分离蛋白质127

IEC柱的清洗130

IEC的优化和常见问题131

参考文献134

网络资源134

离子交换介质的供应商134

第7章 尺寸排阻色谱135

小分子更易进入凝胶介质间的空隙136

分配系数Kd和有效分配系数Kav描述了溶质在特定凝胶中的洗脱情况137

SEC分离相似形状分子的能力取决于凝胶的选择范围139

分子的形状对其洗脱时间的影响139

影响洗脱蛋白分辨率的因素140

SEC在纯化方案中的作用141

SEC中缓冲液、溶液和试剂的配制141

SEC中蛋白样品和肽样品的预处理142

SEC液相色谱装置142

利用SEC分离纯化的例子147

实验方案151

方案1尺寸排阻色谱柱的填装151

方案2尺寸排阻色谱的制备154

附加方案：分析性尺寸排阻色谱157

方案3用尺寸排阻色谱进行蛋白质的脱盐和缓冲液的更换158

柱的清洗和保养操作159

关于SEC的常见问题161

参考文献162

第8章 反相高效液相色谱在蛋白质分离和纯化中的应用163

RP-HPLC的特点与机制164

分离机制165

RP-HPLC基于“疏水脚”的细微差异分离多肽166

RP-HPLC柱的特点与操作166

流动相171

温度174

表面活性剂对反相分离的影响174

在质谱鉴定前用RP-HPLC分级分离多肽174

RP-HPLC常见问题指南176

实验方案177

方案1 RP-HPLC分离蛋白质的标准色谱条件177

方案2 RP-HPLC分离多肽的标准色谱条件183

参考文献188

选读文献188

网络资源188

第9章 疏水相互作用色谱189

HIC与RP-HPLC的区别190

HIC的基本原理191

实验的影响因素192

实验方案196

方案1用HIC分离蛋白质196

参考文献198

第10章 亲和色谱与免疫亲和色谱199

亲和色谱的实际应用201

凝集素亲和色谱202

配基亲和色谱205

免疫亲和色谱206

DNA亲和色谱207

共价色谱210

采用巯基-二硫键互换反应的共价色谱211

实验方案215

方案1凝集素-琼脂糖凝胶亲和色谱215

方案2蛋白质配基亲和色谱218

方案3制备抗体亲和树脂过程中抗体的定位221

方案4 DNA亲和柱的制备223

方案5 DNA亲和色谱227

方案6从仅被混有不可逆失活的亚磺酸氧化产物中以可逆失活混合的二硫化物形式纯化木瓜蛋白酶232

方案7以琼脂糖-谷胱甘肽-2-吡啶二硫化物凝胶作为填料的共价色谱235

方案8使用活化的Thiopropyl-Sepharose 6B凝胶的共价色谱241

参考文献249

网络资源250

第11章 蛋白质组学研究中的染料配基亲和色谱251

方法的设计和优化254

染料配基吸附剂的再生和储存258

实验方案259

方案1染料在多羟基介质中的固定化259

附加方案：固定化配基浓度的测定262

方案2通过结合目的蛋白的能力来筛选固定化染料263

方案3吸附条件的优化265

方案4洗脱条件的优化266

方案5分批式试管法计算吸附剂的有效容量268

方案6用染料配基亲和色谱纯化蛋白269

研究实例：使用Cibacron Blue 3GA-Sepharose亲和吸附剂纯化重组甲酸脱氢酶271

参考文献272

第12章 固定化金属离子亲和色谱273

IMAC的基本原理274

IMAC的基本操作276

IMAC最常用于纯化带多聚组氨酸标签的蛋白质277

目的蛋白性质未知时可使用IMAC278

磷蛋白和磷酸肽的分离278

实验方案280

方案1IMAC预装柱的准备280

方案2填装IMAC柱281

方案3制备含组氨酸标签蛋白的大肠杆菌澄清提取物283

方案4～6的导言：在非变性条件下纯化组氨酸标签蛋白285

方案4利用未经参数优化的IMAC纯化组氨酸标签蛋白286

方案5优化咪唑浓度来提高蛋白质分离效率288

方案6利用咪唑梯度用IMAC纯化组氨酸标签蛋白291

方案7～8的导言：在变性条件下用IMAC纯化组氨酸标签蛋白294

方案7变性蛋白样品的制备295

方案8在变性条件下用IMAC纯化组氨酸标签蛋白297

IMAC柱的清洗300

IMAC柱的保存300

IMAC疑难问题的解决300

12.6 IMAC研究实例303

参考文献305

第13章 用羟磷灰石进行蛋白质色谱307

基本概念308

应用312

实验方案315

方案1用羟磷灰石结晶粉进行色谱315

方案2用陶瓷羟磷灰石进行高效液相色谱318

参考文献322

第14章 色谱聚焦323

引言324

实验方案327

方案1制备凝胶和柱子327

方案2制备样品：变换缓冲液和脱盐332

方案3利用色谱聚焦法纯化蛋白335

方案4从样品组分中去除Polybuffer和Pharmalyte338

方案5柱子的清洗、再生和保存340

色谱聚焦研究实例343

参考文献346

第Ⅲ部分：蛋白质组学中制备蛋白样品的电泳方法349

第15章 电泳分离蛋白质策略导论349

通过制备电泳富集低丰度蛋白353

第Ⅲ部分概述355

参考文献357

第16章 双向凝胶电泳分离蛋白质359

样品的制备360

预分离和亚分离操作362

用IPG进行双向凝胶电泳363

IPG-IEF的一般指导原则363

蛋白质的显示368

差示凝胶电泳369

2D胶疑难问题的处理370

实验方案371

方案1细胞和组织样品的提取和增溶371

方案2小麦种子（T.aestivum）蛋白质的顺序提取375

方案3用Sephadex-IEF进行小鼠肝脏蛋白的预分离377

方案4 IPG胶条用IPGphor单元来进行IEF381

方案5 IPG胶条的平衡385

方案6在垂直电泳单元中进行的多个SD-PAGE387

方案7荧光差示凝胶电泳390

参考文献394

网络资源395

第17章 在MCE中通过等电位分段法进行高分辨率双向凝胶电泳来制备样品396

窄范围IPG可提高蛋白质分辨率397

MCE将样品分成窄的等电位分段398

实验方案401

方案1MCE分段法401

MCE血浆蛋白分段的结果404

人血浆的窄范围碱性分段405

玉米（ZEA MAYS）晶胚的分段406

参考文献407

第18章 一种电泳纯化蛋白质的方法：Gradiflow BF400仪408

Gradiflow BF400仪的介绍410

Gradiflow BF400仪的分离原理411

用Gradiflow BF400仪进行分离的技术方案的发展411

实施根据电荷进行的分离413

实施根据大小进行的分离414

实例分析：在蛋白质组学分析中按大小对蛋白样品进行分级分离414

实验方案416

方案1从血浆或血清中制备多克隆抗体416

方案2从组织培养上清液中浓缩蛋白419

方案3从血浆中去除清蛋白421

Gradiflow BF400仪的特征424

参考文献425

第19章 用自由流动电泳技术纯化蛋白质426

引言427

实验方案429

方案1天然IEF-FFE分级分离粗蛋白混合物429

方案2变性IEF-FFE分级分离粗蛋白混合物437

参考文献439

第Ⅳ部分：用于结构蛋白质组学的纯化蛋白的分析443

第20章 已纯化蛋白质鉴定方法导论443

结构基因组学：是否可以从结构推知功能？444

蛋白质微阵的进展445

已纯化蛋白的功能完整性445

第Ⅳ部分概述448

参考文献450

网络资源451

第21章 用质谱测定蛋白质的特性452

一级结构的测定453

二级结构的测定：二硫键464

三级结构和四级结构的测定：蛋白质构象、蛋白质折叠和蛋白质-蛋白质相互作用467

参考文献474

第22章 分析超速离心：蛋白质大小、构象和相互作用478

分析超速离心的原理479

理论480

文献示例483

实验上的问题487

结论490

参考文献491

网络资源492

第23章 蛋白质构象稳定性的测定493

用光谱学技术追踪去折叠494

通过氢交换来测定蛋白质的构象稳定性503

比较由NMR和其他方法测得的ΔGu505

结束语507

实验方案508

方案1尿素储液的制备508

方案2测定尿素或盐酸胍去折叠曲线510

方案3测定热去折叠曲线512

方案4用NMR法测定蛋白质构象的稳定性514

参考文献517

第24章 表面等离子体共振与质谱联用：鉴定结合配体及描述相互作用519

SPR生物传感器520

配体垂钓以及应用SPR生物传感器和质谱进行鉴定520

实例分析：配体垂钓以及从脑提取物中鉴定钙调蛋白522

参考文献529

第25章 糖蛋白中糖的分析530

历史背景532

聚糖与蛋白质最常用的连接是通过天冬酰胺、羟基氨基酸和GPI锚535

可以用多种方法检测蛋白质的糖基化539

用化学方法和酶学方法可以从糖蛋白中释放聚糖544

寡糖的混合物难以分离548

可以用物理方法、化学方法和酶学方法描述聚糖的结构特征553

实验方案566

方案1用氟化氢使糖蛋白脱糖基566

方案2单糖组成分析：糖醇乙酸酯568

方案3用甲醇解法分析单糖572

附加方案：磷酸化糖的重氮甲烷甲基化574

方案4用NaOH甲基化方法进行连接分析576

参考文献580

网络资源583

附录1 蛋白质结构概述584

附录2 蛋白质浓度的测定605

附录3 蛋白质溶液的浓缩644

附录4 蛋白质的储存稳定性672

附录5 单向聚丙烯酰胺凝胶电泳688

附录6 疑难问题解决指南702

附录7 注意事项715

索引728